- 1
- 2
- 3
<table id="dsoqc"></table>
.jpg)
.jpg)
地址：杭州余杭經濟技術開發區興國路519號生物醫學谷5號樓二樓
郵編：311188
電話：0571-89028163
手機：13003659111/13093769111
商務QQ：1269136227
聯系人：吳女士
PCR 擴增后的產物往往要克隆到載體中，傳統的克隆方法主要有限制性酶切與連接法和 TA 克隆法。由于在 PCR 片段的兩端酶沒有足夠的空間和其結合，因此 PCR 片段的酶切比質粒酶切要困難的多。為了把 PCR 片段克隆到其他的另外的載體中，第一步是把 PCR 片段克隆到 T vector 或 pUC18 這樣的 PCR 克隆載體中。但是 TA 克隆的缺點也很明顯，諸如需要單獨購買 T 載體，連接效率不高，需要進行亞克隆等。
如何把 PCR 片段直接克隆到一個克隆載體中？
有時需要把 PCR 片段直接克隆到一個克隆載體中。PCR 片段和載體使用同樣的酶進
行酶切。把經過酶切的 PCR 片段和經過酶切的載體連接起來。
要使這種酶切和連接的成功率更高，以下幾點非常重要：
– 設計引物時需要加保護堿基。
– PCR 片段酶切需要的時間可能比質粒酶切時間長。
– 如果直接克隆很困難，可以先 PCR 片段克隆到 T vector 或 pUC18 這樣的 PCR克隆載體中，然后再克隆到另外的載體。
– 為了節省時間，明智的選擇是克隆到 T vector 或 pUC18 這樣的 PCR 克隆載體和克隆到另外的載體同時進行。
– 片段與載體的量要足夠.
如何更換載體？
在做克隆之前，作酶切位點的分析很重要：
– 用于克隆的酶在目的載體和基因片段都必須是唯一的。
– 請檢查要使用的酶切位點在目的載體的位置。如果兩個酶切位點挨的很近，先進行一個酶切，再進行另一個酶切很必要。也就是說，先用第一個酶切質粒，進行完膠回收后再進行第二個酶切。
– 酶切要使用足夠量的質粒：有足夠的質粒用于酶切和膠回收很重要。一個克隆培養 15mL 培養基，小量抽提質?？梢垣@得足夠質粒。
– 如果使用的酶對于目的質粒沒有切開，可以用這個酶切一下 pUC18 以便檢查這個酶是否好用。如果這個酶能酶切 pUC18 而不能酶切你的目的質粒，解決辦法是重新制備你的目的質粒。如果這個酶不能酶切 puc18，解決辦法是從另外的公司重新定購這個酶。
如何觀察陽性克??？
在作克隆時，同時作一個陰性對照很重要。例如作連接時，載體自連作一個，插入片段自連作一個。
理想的情況應該是這樣的：
– 如果在陰性對照的平板上長 10-20 個克隆。而在你連入片段的平板上長超過40 個克隆。在這種情況下，挑選一些克隆作檢測，就可以挑選出陽性克隆了。
– 如果在陰性對照的平板上沒有長克隆，就有些麻煩了，有可能酶切時間過長，導致酶切和連接失敗。
酶切克?。?/strong>
盡量使用相同公司的酶，先低鹽后高鹽，Buffer 控制在活力 50%以上，盡量考慮通用Buffer。
所有的限制性內切酶切割 DNA 均產生含 5′磷酸基和 3′羥基基團的末端。有些酶能使其識別序列相對兩鏈之間的數個堿基對(base pairs)分開，形成 5′末端突出的粘性末端。還有一些酶產生具有 3′末端突出的粘性末端。如圖所示
EcoRI5′-G▼AATT C-3′ MunI5’-C▼AATTG-3’
3′-C TTAA▲G-5′ 3’-GTTAA▼C-5’
而另有一些酶切割 DNA 后產生平頭或鈍性末端(blunt end)，如HpaI: 5′- GTT▼AAC -3′ SmaI: 5′- CCC▲GGG -3′EcoRV: 5′- GAT▲ATC -3′
3′- CAA▲TTG -5′3’ - GGG▲CCC-5’ 3’- CTA▲TAG-5’
有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割 DNA 后產生相同類型的粘性末端，稱配伍末端(compatible end），可進行相互連接；產生平端的酶切割 DNA 后，也可彼此連接。
TA 克隆
原理：應用了 taq DNA polymerase 的擴增特性，在擴增后的片段尾部自動加一個 A，根據堿基配對原則，人為設計出末端含有 T 的載體，AT 配對，在 T4 DNA ligase 的作用下，把片段和載體連接在一起。PCR 片段克隆到 T vector 克隆載體：T vector 在載體的兩端各有一個突出的 T。如果擴增 PCR 片段使用的是 Taq 酶，那么擴增出的 PCR 片段在其兩端都有一個突出的 A。這樣 T vector 和 PCR 片段的 TA 堿基配對就很容易克隆。
每個人掌握 PCR 片段克隆到 T vector 克隆載體這個技術是很重要的。但是請記住如果擴增 PCR 片段使用的是 pfu 等具有外切酶活性的酶，克隆到 T vector 不適用。
平末端克隆
首先將載體線性化，然后 CIAP 去磷酸化處理。 連入片段?？寺》较蚝洼d體自連問題比較突出。
<table id="dsoqc"></table>