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        競爭Elisa:間接法與直接法的差異
        2015-12-9
        來源:丁香園論壇
        點擊數: 11847          作者:象棋篩子
        • 一、定義
              間接競爭法的模型:包被抗原,用HRP-抗體與樣本一起加入。樣本中的Ag與Solid-Ag競爭HRP-Ab,固相吸附的HRP-Ab與樣本中的Ag濃度成反比。
              直接競爭法的模型:包被抗體,用HRP-抗原與樣本一起加入。樣本中的Ag與HRP-Ag競爭Solid-Ab,固相吸附的HRP-Ag與樣本中的Ag濃度成反比。
          二、競爭法的理論基礎:是限量抗體。只有在限量抗體基礎上,兩種抗原才會形成競爭關系。
          三、間接競爭法具備較高靈敏度原因。
              直接競爭法里,標記抗原與待測抗原均是液相,與抗體的結合機會是一樣的,例如有1份標記抗原與1份待測抗原競爭1份抗體,那么有50%的標記抗原能與抗體結合,所以標記抗原的相對結合率為50%。間接法里,固相抗原與抗體的接觸面積較小,固相抗原與待測抗原的結合抗體機會是不平等的,接近順序飽和法,即只有與待測抗原結合剩余的抗體才會與固相抗原結合,同樣有1份固相抗原與1份待測抗原競爭1份抗體時,基本上抗體會被待測抗原中和掉,與固相抗原結合的抗體非常少。固相抗原的相對結合率為0%。因此,間接法的抑制曲線斜率會大于競爭法。


              因為抑制率越大則斜率越大,從而靈敏度越大。(假設零管變異5%,以兩倍SD為靈敏度限,則為90%相對結合率,則間接法可以在較低的待測抗原濃度達到這一相對結合率,因此靈敏度要高。)
          在進行系統放大時,間接法一般可以使用酶標二抗。因為二抗可以針對抗體的多個部位,所以存在放大效應,從而能提高間接法的靈敏度。直接法一般難以進行放大,常用的有生物素化抗原與酶標親和素,但模式上似乎不存在放大效應。
          四、間接法的高靈敏度難以實現的原因:
              雙抗體夾心的免放(IRMA)模式剛出現時,也被模型證明靈敏度優于競爭法的放免(RIA),原因也是較大的斜率,但是IRMA的高靈敏度一直到單抗發展后才得以實現。間接法的高靈敏度也有其實現的條件,其中有幾點最為可疑:
              固相抗原與液體抗體的結合位點問題。很多時侯小分子直接包被或多肽包被后與液體抗體結合位點受到干擾,親和力下降。一般小分子必須衍生后進行包被,但仍可能導致親和力的下降。固相抗原與液體抗體的接觸面積較少,因此需要更長時間去達到平衡。競爭法的基礎在于限量抗體,即兩種抗原競爭有限抗體。在間接法里,由于抗原與抗體結觸面較少,除非無限延長時間,否則可能只有較少的抗體能被固相抗原捕獲,從而導致最終固相化的酶數量較少,最終的吸光度變低。而在直接法里,雖然接觸面是一樣的,但所有的抗體都在接觸面上參與反應,所以最終固相化的酶要多一些。3)直接法時抗體先固相化,一般是FC結合聚苯乙烯,針對不同抗原位點的抗體都能與標記抗原反應。因此,參與競爭的是針對所有位點的多抗。而間接法時,固相抗原的位點受到影響,部分抗原位點會消失。這時侯,針對這些位點的抗體將只與待測標本中的抗原反應。待測標本中的抗原需要先將這些抗體中和掉,剩余的抗原再與固相抗原競爭剩余的抗體。通過篩選與固相抗原結合力不變的單抗可以解決這一問題。象棋篩子象棋篩子

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